杜氏肌营养不良（DMD）是一种发病率相对较高的单基因疾病，由X染色体上编码肌营养不良蛋白（Dystrophin）的基因突变，导致无法产生足够的抗肌萎缩蛋白，患者的肌肉组织逐渐被脂肪和纤维化组织取代，大约每5000名新生男婴中就有1人患病。

近年来，已有几款治疗DMD的反义寡核苷酸（ASO）药物获批上市，通过外显子跳跃达到治疗目的，但这些药物只能覆盖少数特定突变位点的DMD患者。

2023年8月24日，日本京都大学的 Akitsu Hotta 团队在 Cell Press 旗下期刊 Stem Cell Reports 上发表了题为：Dual CRISPR-Cas3 system for inducing multi-exon skipping in DMD patient-derived iPSCs 的研究论文。

该研究开发了一种双重CRISPR-Cas3系统进行多外显子跳跃（MES），能够诱导杜氏肌营养不良（DMD）患者来源的诱导多能干细胞的肌营养不良蛋白（Dystrophin）基因外显子45-55区域的大片段缺失（~340kb），产生截短但仍有功能的肌营养不良蛋白，该方法能够覆盖60%以上的DMD患者。此外，该研究未发现明显的脱靶缺失。

这项研究表明，双CRISPR-Cas3系统是一种很有前景的工具，可通过多外显子跳跃（MES）诱导大片段基因组缺失，启发了治疗DMD和其他需要大量删除基因片段的遗传疾病的新方法。

由于影响肌营养不良蛋白基因的突变模式存在显著差异，因此，跳过或删除一小部分片段只适用于有限的DMD患者。例如，最常见的外显子51、53和45的单外显子跳跃分别适用于13%、8%和8%的DMD患者。

多外显子跳跃（MES）广泛适用于多种DMD突变模式。通过靶向肌营养不良蛋白基因的突变热点，研究人员估计外显子45-55的MES，能使60%以上的DMD患者受益。然而，很少有技术可以诱导如此大片段的基因删除，以覆盖分布在几百个碱基上的目标外显子。

为了克服这一障碍，研究团队使用CRISPR-Cas3在各种DMD突变模式的肌营养不良蛋白45-55外显子区域诱导了多达340kb的缺失。因为使用单个CRISPR RNA基本难以删除超过100bp，所以研团队在目标基因组区域内使用了一对CRISPR RNA。

研究团队指出了这种双CRISPR RNA系统的潜在局限性。首先，删除模式存在变异，其精确起点和终点无法完全控制。当需要大量但精确删除时，这可能是一个缺点。其次，该研究没有证明肌营养不良蛋白功能的恢复情况。第三，还需要开发其他方法来提高Cas3系统的整体基因组编辑效率。

论文通讯作者 Akitsu Hotta 表示，双CRISPR-Cas3是一种很有前途的工具，可以通过多外显子跳跃诱导来实现基因删减。一旦能够将双CRISPR-Cas3系统安全有效地递送到体内骨骼肌组织中，就有望应用于未来的基因治疗。此外，诱导数百个DNA碱基缺失技术本身在基础研究中也具有广泛的适用性。希望这项研究能够启发治疗DMD和其他需要大量删除基因片段的遗传疾病的新方法。

论文链接：

https://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711(23)00295-3