Cell：利用单碱基基因编辑更正人类T细胞免疫缺陷突变

编辑:中国基因网发布于:基因治疗2023-03-293908

CD3δ严重联合免疫缺陷（SCID）是一种危及生命的先天性免疫缺陷，是由常染色体CD3D基因的双等位基因突变引起的。CD3δ对于T细胞受体（TCR）的组装至关重要，因此，缺失CD3δ会导致严重的免疫缺陷，CD3δ SCID患者会出现严重的T细胞缺乏，常常导致婴儿期死亡。

异体造血干细胞移植（HSCT）是一种可能的治疗方法，但是可能出现致命的移植物抗宿主病（GvHD），在之前的研究中，经历异体HSCT的CD3δ SCID患者生存率仅为61.5%（n=13），并且大多数患者会出现急性GvHD，2名患者发展为慢性GvHD【1】。

为了避免GvHD，后来人们想要利用患者自身基因改造过的造血干细胞和前体细胞（HSPC）进行自体HSCT，一开始人们通过慢病毒载体来表达基因，但是由于慢病毒会诱导致癌突变，后来人们利用CRISPR-Cas9同源修复（HDR），但目前尚未用于临床试验，而且CRISPR-Cas9需要细胞分裂来完成双链断裂和修复，难以在造血干细胞中实现高效修复，还具有脱靶的风险，而碱基编辑（BE）不需要双链DNA断裂或供体DNA模版，腺嘌呤碱基编辑器（ABE）是由催化活性受损的Cas9切口酶（Cas9n）与一个修饰DNA的脱氨酶融合在一起组成的，可以直接将A-T转变成G-C碱基对，因此可能是一个治疗CD3δ SCID的有效方法。

2023年3月20日，来自美国加州大学洛杉矶分校的Donald B. Kohn研究团队在Cell上发表题为Human T cell generation is restored in CD3δ severe combined immunodeficiency through adenine base editing 的文章，报道了ABE策略可以在自体造血干细胞和前体细胞（HSPC）中恢复CD3δ的表达，在CD3δ SCID患者的HSPC中进行碱基编辑可以更正约71.2%的致病突变，编辑后的人类HSPC移植到免疫缺陷小鼠体内可以更正约88%的致病突变，证明了ABE治疗CD3 SCID的临床前有效性。

为了研究ABE是否是治疗CD3δ SCID的合适的方法，研究人员首先构建了一个T细胞疾病模型，将CD3D突变（C202T），随后用ABE或Cas9介导的HDR进行修复，结果发现HDR的修复率为28%左右，indel副产物有大约53%，而用不同的ABE进行编辑，几乎没有indel产生，且最高的编辑率为93%。在该T细胞疾病模型中，ABE可以功能性恢复CD3δ的表达水平和信号传导。并且在CD3δ SCID患者的HSPC中用ABE进行编辑，致病突变被更正的概率大约为71.2%（n=3）。

然后他们检测了靶点附近的非目的突变和基因组上的脱靶编辑，发现ABEmax-NRTH（ABE的一个变体）是脱靶最少，最安全有效的，只有极少数的靶点附近的非目的编辑，而且并不影响健康的T细胞功能。这些编辑后的HSPC可以在人工胸腺类器官中分化，产生成熟的具有不同TCR的功能性T细胞。

接下来他们利用人类HSPC移植到小鼠模型中进行验证，首先将健康人的HSPC用慢病毒转染编辑成致病的CD3D C202T，然后电转ABEmax-NRTH进行编辑，将这些细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，16周后从小鼠骨髓中分理出来CD34+细胞，发现有大约88%的细胞中的致病突变都被更正了，说明这些被编辑的HSPC可以重新形成造血系统，并长期维持更正致病突变的细胞群体。

CD3δ SCID的HSPC存在发育缺陷，其分化不会超过CD4 CD8双阳性的T细胞前体阶段，但是碱基编辑之后的HSPC可以挽救T细胞的发育缺陷，可以发育成为具有不同TCR的功能性T细胞。