填补细胞疗法的缺失一环：基因改造B细胞，这项研究实现效率大提升

编辑:中国基因网发布于:基因治疗2023-05-044115

近年来，以CAR-T疗法为代表的细胞疗法方兴未艾，迅速成为生物医药领域的焦点。多种细胞疗法不仅已经在血液肿瘤领域给患者带来新生，而且在实体肿瘤、传染性疾病、自身免疫病等广泛领域同样展现出巨大的潜力，有望改写治疗格局。

目前免疫疗法的主要改造对象是T细胞。相比之下，另一类主要免疫细胞——B细胞似乎受到了冷落。但事实上，对B细胞的工程化改造同样潜力巨大。B细胞构成了体液免疫的基础，一旦被抗原激活，初始B细胞就会增殖分化，形成生发中心，并分化成记忆B细胞与浆细胞。其中，浆细胞也被称作抗体分泌细胞，是抗体的生产工厂，持续向血清中释放大量抗体——大多数疫苗的保护作用正是来源于此。

因此如果能借助基因编辑工具改造B细胞、使其表达针对特定病毒的广谱中和抗体再输回体内，将有望为包括HIV在内的疾病提供全新疗法。再加上B细胞在外周血液中含量丰富、易于获取，并且具有高蛋白表达能力，这些特征使得B细胞成为细胞疗法的潜在靶点。

目前，这种工程化改造B细胞的研究已经在许多小鼠实验中展现出了应用潜力，但距离临床试验仍有需要跨越的障碍。除了安全性、持续性、疗效等问题，另一个急迫的挑战是如何从小鼠实验放大到非人灵长类等大动物。非人灵长类动物，尤其是常见模式动物恒河猴，为检验B细胞疗法的相关指标提供了理想的模型。但要从小鼠实验步入灵长类动物试验，找到更加高效的B细胞改造手段是绕不开的难题。

近期，在一项发表于Journal of Visualized Experiments（JoVE）期刊的研究中，由美国洛克菲勒大学Michel Nussenzweig教授领导的团队创建了一套利用CRISPR/ Cas9系统，在体外快速、高效地编辑恒河猴原代B细胞的全新方案，为基于恒河猴等非人灵长类动物模型的B细胞基因疗法临床前研究提供了强有力的工具。

谈到CRISPR/ Cas9基因编辑工具，我们熟悉的称呼是“基因魔剪”。事实上，“剪开”基因只是开始，在DNA双螺旋结构断裂后，细胞会迅速启动修复机制。其中，同源定向修复（HDR）是一类常见的修复机制。这个修复过程需要引入一套包含了目标基因序列的外源DNA作为修复模板，从而实现精准的基因编辑。

在这项研究中，研究团队应用CRISPR/ Cas9核糖核蛋白（RNPs）和重组腺相关病毒6（rAAV6）作为同源定向修复模板（HDRT），用于对体外培养的恒河猴B细胞进行精准的基因编辑。

要将基因编辑工具递送至目标区域，“交通工具”也就是载体必不可少。腺相关病毒（AAV）是一类理想的载体，由于存在复制缺陷，AAV仅在腺病毒等辅助病毒存在的情况下才会自我复制，因此安全可靠。而在AAV基础上改造得到的重组腺相关病毒（rAAV）进一步避免了基因整合风险，并且具有宿主细胞范围广、免疫原性低，在体内表达外源基因时间长等优点，被视为最有前途的载体之一。这项研究使用的rAAV6正是其中之一。

然而，rAAV的高效、低成本生产始终是一道难题。传统的三质粒包装系统是由质粒通过转染进入HEK293细胞来进行rAAV的包装，成本高、耗时长且可放大性有限。因此，这项最新研究使用了不依赖转染的大规模、高效生产rAAV的新一代病毒载体生产技术TESSA™。

TESSA™技术由药明生基全资英国子公司OXGENE自主开发，其基本思路是利用腺病毒的辅助作用提升rAAV生产效率，同时采用了诱导型启动子来避免rAAV生产过程中腺病毒污染。TESSA™充分利用了腺病毒的生命周期：腺病毒的早期基因供了rAAV复制和包装辅助功能，可以加以利用；同时通过引入操控基因开关——四环素控制元件遏制晚期基因表达，阻止腺病毒进入合成结构蛋白的晚期阶段，从而避免了腺病毒复制所带来的污染。在今年迈阿密举办的首届先进疗法颁奖典礼上，药明生基还凭借TESSATM技术荣获2022年度技术颠覆者大奖。

在这项研究中，Nussenzweig教授团队对比了TESSA™ 和传统的无辅助三质粒共转染途径生产rAAV6的效果。结果显示，相比于传统手段，应用TESSA™可将rAAV6的产量平均提升30~40倍，实现了快速、高效的恒河猴B细胞基因编辑。