干细胞治疗被誉为“人类医疗史上第三次革命”。自20世纪50年代以来，这项技术已在糖尿病、帕金森综合征、红斑狼疮、白血病等多种疾病中进行了相应治疗尝试。特别是造血干细胞的应用，改善了多种免疫/血液系统疾病的预后。自2006年以来，诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）的制备技术及其应用，将干细胞治疗带入了一个全新时代。随着分子生物学技术，特别是基因编辑技术的不断发展，基因修饰在干细胞治疗中发挥着越来越重要的作用，并为多种疾病的治疗带来希望。本文将概述基因编辑技术在干细胞治疗中的应用。


一、CRISPR/Cas9具有广阔的应用前景

基因编辑是一种在基因组上产生目的序列缺失/插入/替换的技术。该技术通过造成DNA双链断裂，诱导DNA修复，从而进行目的基因编辑。CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术相较于第一代锌指核酸酶和第二代类转录激活因子效应物核酸酶编辑技术具有明显优势。CRISPR/Cas9依赖的内切酶Cas9含有2个切割结构域——RuvC和HNH，具有切割核酸双链能力。同时， 其识别序列为单链RNA，而非氨基酸链，结构较前两代精简，效率提高的同时成本更低。CRISPR/Cas9系统发挥作用时，具有识别作用的sgRNA与目标序列互补结合，Cas9则在PAM序列上游的3-5bp处进行双链切割。因其具有高效性、高特异性等特征，CRISPR/Cas9系统自2012年被应用于细菌以后，便迅速发展并被用于哺乳动物细胞的基因编辑。

目前，CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因等基础研究领域显示出强大功能。在过敏、血液疾病及肿瘤等多种疾病治疗的细胞药物开发中，CRISPR/Cas9也被广泛应用，并取得了显著成效。此外，2014年开始兴起的CRISPR Screening具有强大筛选作用，通过sgRNA文库的大批量构建，已筛选出诸如细胞焦亡等多种生物学过程中的关键分子，也发现了肝细胞癌和免疫缺陷疾病等多种疾病的治疗靶点。总之，CRISPR/Cas9基因编辑技术在生物医药各领域具有极其广阔的应用前景，推动了该领域的快速发展。


二、CRISPR/Cas9在干细胞治疗中的应用

在干细胞治疗领域， 某些疾病仅靠单纯的细胞替代并不能取得满意效果。利用逆转录病毒和慢病毒将外源目的基因整合到干细胞基因组，仅对基因功能缺失的遗传病具有良好疗效，但也存在一定致瘤风险。相比之下，CRISPR/Cas9基因编辑技术能够精确实现基因敲入、敲除及碱基修复。因此， 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对干细胞进行基因改造，不仅能够增加干细胞治疗的疾病范围，也能更大程度地保证治疗的安全性。目前，CRISPR/Cas9在干细胞治疗领域发挥着重要作用，同时更多由CRISPR/Cas9编辑的干细胞药物正在开发中。

HSC移植是治疗先天性免疫缺陷和血液疾病的相对成熟方案。然而，合适配型的供体缺乏导致移植受到极大限制。因此，有必要对自体HSC进行基因编辑以改善其功能，为相关疾病治疗提供可靠有效的HSC来源。截至目前，已有多个临床试验采用CRISPR/Cas9对HSC进行基因编辑，进而治疗血液疾病或免疫系统疾病。如修复HSC的IL2RG基因，回输给患者后可治疗X型SCID；敲除CCR5基因可增强患者对HIV病毒的抵抗能力；修复PKLR基因可有效缓解丙酮酸激酶缺乏症；敲除BCL11A基因可激活γ-珠蛋白表达，从而治疗镰状细胞贫血和β-地中海贫血。同时，在诱导造血干细胞（induced hemopoietic stem cell，iHSC）中，对编码β-珠蛋白的基因HBB进行单碱基修复也增强了对镰状细胞贫血的治疗效果。

相较于各成熟细胞，iPSC更易进行基因修饰，且拥有强大的扩增能力及多向分化能力。这些特性有利于开发相对均一的通用现货型细胞药物。就药物质控和开发成本而言，采用基因编辑的iPSC进行细胞药物开发必将成为大势所趋。Fate Therapeutics公司的细胞药物FT819，是一种在iPSC的T细胞受体α基因座中插入CAR，进而分化产生不受患者限制的通用CAR-T细胞，也是首个现货型、iPSC来源的CAR-T药物。已有研究发现，利用CRISPR/Cas9敲除HLA-A和HLA-B基因可增强iPSC的免疫相容性，大幅度降低免疫排斥风险。敲除CISH基因可延长体外iPSC分化至NK细胞的周期，同时能够增强NK细胞的杀伤功能，提高抗肿瘤活性。

除了HSC和iPSC治疗外，CRISPR/Cas9在其他干细胞治疗中也有广泛应用。如采用CRISPR/Cas9敲除人表皮干细胞COL7A1基因的80号外显子，可矫正隐性营养不良型大疱性表皮松解症。在心肌梗死大鼠模型中，同种异体间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）的B2M基因被下调后，免疫排斥反应受到抑制，心脏修复功能增强，生存率显著提高。

综上所述，CRISPR/Cas9应用于干细胞治疗领域，不仅提高了治疗效果，增加了可治疗疾病范围，在安全保障方面也显示出积极作用。


三、干细胞治疗的现状与挑战

干细胞治疗作为一种再生医学技术，旨在用具有特定功能的细胞替代功能异常细胞，恢复相应细胞功能，改善机体健康状态。目前有多种干细胞用于临床， 其中，HSC移植已改善多种免疫系统和血液系统疾病的预后，如先天性免疫缺陷、多发性骨髓瘤、地中海贫血等。研究数据表明，异体HSC的植入可将r/rAML（IDH1/IDH2突变的急性髓系白血病）患者的4年生存率提高至20%~35%。自2006年问世以来，iPSC制备技术发展逐渐成熟，在细胞治疗领域展现巨大潜力。全球多家公司及科研机构加入了iPSC细胞药物开发大军，发现其对帕金森综合征、老年黄斑变性眼病、重度心力衰竭等多种疾病有良好效果。此外，MSC因具有一定的免疫调节功能，被用于治疗免疫性疾病，如移植物抗宿主病等， 取得了一定疗效。目前，部分干细胞药物已成功上市，如用于治疗腺苷脱氨酶缺乏性重度联合免疫缺陷病（ADA-SCID） 的自体HSC药物Strimvelis及用于治疗阿尔茨海默病的自体MSC药物AstroStem。

某些遗传病一方面由于自体干细胞同样存在相应基因异常，直接输入不能明显改善症状。 功能正常的异体干细胞虽能改善症状，但配型成功概率很低，存在排斥风险。因此，对这类遗传病单纯输入干细胞并不是有效方案，需要对自体或异体干细胞进行相应基因修饰，以恢复其功能或降低排斥风险。早期干细胞基因修饰主要利用γ-逆转录病毒和慢病毒载体插入外源目的基因，恢复细胞功能。但这两种病毒在基因组内的整合具有一定随机性，特别是前者具有较高致癌率。因此，需要更安全的技术来完成干细胞的基因修饰。这种整合外源基因的干细胞通常是针对特定基因功能缺失的疾病，对功能获得性基因突变所致的疾病，并不能起到治疗作用。此外，一些基因表达需要控制在一定生理水平。病毒载体虽能提供正确的基因序列，但难以精确控制其表达，因而对相应疾病也不能取得良好效果。基于此，干细胞治疗领域需要更精确的基因改造技术，实现原位修复目的基因，进而治疗更多类型的疾病。


四、展望

第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9发展至今，已衍生出不同功能工具。如依赖非同源末端连接的基因敲除、依赖同源末端修复和模板序列的基因敲入或修复、利用突变dCas9与碱基编辑蛋白融合的单碱基突变修复、构建sgRNA文库筛选靶点等。在干细胞治疗领域，CRISPR/Cas9无疑拥有广阔前景。临床试验表明，CRISPR/Cas9可恢复特定患者干细胞的基因功能，相应自体干细胞治疗成为可能。此外，CRISPR/Cas9还可敲入/敲除某些基因，增强干细胞功能及安全性，这些同样能够促进干细胞的临床应用。虽然当前CRISPR/Cas9介导的基因插入效率还有待提高，但基因敲除的效率能够满足临床需求。整体水平上， 使用CRISPR/Cas9编辑的干细胞在临床试验中取得了明显疗效，预计未来的使用频率会进一步提升。

人体内除HSC 等少数种类外，其余不易获取。因此，长期以来，干细胞治疗仅限于少数疾病。随着iPSC制备和相关应用技术的发展，这一局限正在被打破。iPSC以易获得性及多向分化潜能而具有十分可观的临床应用前景。同时，iPSC易进行基因编辑，可通过该技术使下游分化的细胞获得不同功能特性，以满足多种疾病治疗需求。可以预测，iPSC与CRISPR/Cas9的结合，将会给医疗行业带来巨大变化。