从单个基因到完整基因组

从单个转录本到整个转录组

从单个生物到复杂的宏基因组

从模式生物到科学家们研究的所有物种

从浩浩荡荡的人类基因组计划到个体化基因检测

这一系列变化都离不开测序技术的发展

个体化基因检测在医学中的应用

工欲善其事，必先利其器。

测序技术的不断进步使人类可以破解生命的密码，是分子生物学迅速发展的强大推动力之一。


测序技术的发展历程

1952年

人们早已知道有两种核酸：DNA和RNA，但在很长一段时间里人们更倾向于蛋白质是遗传物质。

1944年，美国微生物学家艾弗里（Oswald Avery，1877-1955）和他的同事通过实验发现DNA是肺炎双球菌转化实验的关键，证实有活性的遗传物质是DNA。赫尔希（Alfred Hershey，1908-1997）和蔡斯（Matha Chase，1927-2003）通过同位素标记的T2噬菌体增殖实验，证实DNA才是遗传物质。这一实验结果很快被人们普遍接受，甚至被当成了DNA是遗传物质的最后证明。

1953年

威尔金斯（Maurice Wilkins，1916 - 2004）和富兰克林（Rosalind Franklin，1920 - 1958）采用X-射线衍射技术分析DNA晶体，沃森和克里克通过一张清晰的DNA衍射照片找到了一种可能的DNA结构，并在Nature发文。

在这篇只有一页多的paper之中，沃森和克里克给出了改变整个生物界的一个图片：DNA双螺旋结构。沃森与克里克这篇仅1000字的论文被誉为“生物学的一个标志，开创了新的时代”。

这是在生物学历史上唯一可与达尔文进化论相比的最重大发现，它与自然选择一起，统一了生物学的大概念，是科学史上的一个重要里程碑，标志着分子生物学的诞生。1962年，沃森、克里克、威尔金斯三人因DNA双螺旋结构的发现而获得当年的诺贝尔生理学或医学奖。遗憾的是富兰克林已于1958年因乳腺癌去世。

1965年

酵母丙氨酸转移核糖核酸（tRNA）具有完全的生物活性，既能接受丙氨酸，又能将所携带的丙氨酸参入到蛋白质的合成体系中，因此在蛋白质生物合成中有着重要作用。

tRNA由76个核苷酸组成，其中除了4种常见的核苷酸外，还有7种稀有核苷酸。美国科学家霍利（Robert Holley，1922-1993）等人确定了第一个完整的核酸序列，即来自酿酒酵母的丙氨酸tRNA。霍利与尼伦伯格、科拉纳共同获得了1968年诺贝尔生理学或医学奖。

1972年

比利时分子生物学家Walter Fiers（1931-2019）测定了人类史上第一个完整的编码蛋白质的基因序列，即噬菌体MS2的衣壳蛋白序列，并于1976年获得了噬菌体MS2的完整基因组。


一代测序技术

1977年，DNA测序技术进展有了重大突破，英国化学家桑格（Frederick Sanger，1918-2013）发明了双脱氧链终止法，吉尔伯特（Walter Gilbert，1932-）和他的学生Allan Maxam（1942-）发明了化学降解法，这两种测序方法都被称为一代测序技术。

（1）化学降解法：即Maxam-Gilbert化学降解法，其原理为：将DNA片段的5’端磷酸基使用放射性同位素标记，再分别采用不同的化学试剂处理修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5’端被标记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。

化学降解法测序原理

（2）双脱氧链终止法：即Sanger法，采用DNA复制原理。Sanger测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物及DNA聚合酶等。其技术核心是ddNTP的使用，由于缺少3’-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力，这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外，这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团，因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。

双脱氧链终止法（Sanger法）测序原理

Sanger的双脱氧链终止法广为人知并且沿用至今，而化学降解法如今已被人逐渐遗忘。

双脱氧链终止法的特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。但由于高精度，一代测序仍然是现今基因检测的金标准，也是对新一代测序结果进行评估验证的主要手段。

而在当时，正是一代测序技术使得基因组的研究成为了可能，浩浩荡荡的人类基因组计划就是利用一代测序技术完成的，人类基因组草图于2001年发表，被认为是人类基因组计划成功的里程碑，比预计时间提前了几年。随着测序技术的不断进步，以及T2T联盟的科研组织的不断努力，2022年4月，《Science》杂志连发六篇特刊，刊登了人类迄今为止完整且无间隙的人类基因组测序结果，填补了人类基因组计划留下的最后8%的序列图谱空白。

Sanger曾经在1958年及1980年两度获得诺贝尔化学奖，是第四位两度获得诺贝尔奖，以及唯一获得两次化学奖的人。其第一次获奖是凭借定序胰岛素的氨基酸序列，证明蛋白质具有明确构造，而第二次获奖就是因为双脱氧链终止法的发明。利用这个技术他成功测定了噬菌体φX174的基因组序列。

Gilbert研究出测定DNA和RNA分子中核苷酸顺序的方法，获1980年诺贝尔化学奖。此外，他也创造了外显子（exon）与内含子（intron）两个名词，来区分mRNA分子中的两个部分。


二代测序技术

二代测序（NGS）技术基于大规模平行测序技术（massive parallel analysis，MPS）方法对大量的目的基因同时进行测序，二代测序平台主要采用的技术有以下三种：边合成边测序（sequencing by synthesis，SBS），连接法测序（sequencing by ligation，SBL，又名SOLiD）和半导体测序（Ion Torrent）。


常见测序技术与平台

Roche公司  454焦磷酸测序

2005年，454生命科学公司（454 Life Sciences）推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，开创了边合成边测序的先河。

2007年初，罗氏诊断（Roche Diagnostics）收购454公司。Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。

2013年，罗氏诊断宣布关闭454测序业务，并于2016年终止相关服务。

Illumina公司  Solexa/HiSeq/MiSeq/NextSeq测序

Illumina公司的二代测序仪应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器。

ABI公司  SOLiD测序

SoLid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器，目前该平台已淡出市场。

华大基因  Complete Genomics/DNBSEQ测序

华大基因于2013年收购美国Complete Genomics（CG）公司，获取了其测序核心技术和其他核心知识产权，随后自己组建研发团队，不断增强自身实力。

Ion Torrent  半导体测序

2007年，454创始人罗森伯格创办Ion Torrent公司。

2010年，Ion Torrent推出了世界上第一台半导体测序仪——个人染色体检测仪PGM。

2010年，Life Technologies收购了Ion Torrent。2012年，Life公司再接再厉推出了功能更为强大的Ion Proton测序仪。

2013年，赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）收购Life Tech。


（1）Roche 454焦磷酸测序：使用边合成边测序技术，避免了Sanger法存在的宿主菌克隆问题。

即首先将目的DNA片段打断成300-800bp的小片段，然后在5’端加上一个磷酸基团，并将3’端变成平端，再在两端加上衔接子组成目的DNA的样品文库。

之后将目的DNA片段固定到磁珠上，将磁珠包被在单个油水混合小滴中进行独立的扩增，从而实现所有目的DNA片段进行平行扩增PCR。

随后将这些DNA放入PTP反应板中共进行后继测序，这里面包含了化学光反应所需的各种酶和底物。

测序开始时，将T、A、G、C按顺序循环单分子进入PTP 板，如果发生配对，则会释放一个焦磷酸盐分子，其在后续与ATP磷酸化酶和虫荧光素反应产生光信号，此光信号被捕获以确定碱基序列。

（2）Illumina Solexa合成测序：使用克隆单分子阵列技术。

首先将目的DNA片段打断成100-200bp，随机连接到固相基质上，经过Bst 聚合酶延伸和甲酸胺变性的桥式PCR循环，生成大量的DNA簇。

之后的反应与Sanger法类似，每次延伸所产生的光信号被标准的阵列光学检测系统分析测序，下一次循环中把终止剂和荧光标记基团裂解掉，然后继续延伸dNTP，实现了边合成边测序技术。

（3）ABI SOLiD连接法测序：

首先制备DNA文库，可以使用片段文库和配对末端文库。第二阶段与焦磷酸测序相同，加入磁珠等反应元件进行emPCR平行扩增，不同的是该方法的磁珠只有1 µm。

在连接测序中，底物是 8 个碱基的八聚体单链荧光探针，在5′末端分别标记了CY5、Teaxs Red、CY3、6-FAM这四种颜色的荧光染料。3′ 端的第 1、2 位碱基类别排序分别对应着一个固定的荧光染料，第 3、4、5 位碱基“n”是随机碱基，第 6、7、8 位碱基“z”是可以和任何碱基配对的特殊碱基。一次测序中包括了五轮连接反应，可以减小测序误差。

（4）华大基因Complete Genomics测序：

华大智造测序仪采用先进的DNBSEQ测序核心技术，通过仪器气液系统先将DNA纳米球（DNA nanoball，DNB）泵入到规则阵列芯片（Patterned Array）并加以固定，然后泵入测序模板及测序试剂。

测序模板与芯片上的 DNB 的接头互补杂交，在DNA聚合酶的催化下，测序模板与测序试剂中的带荧光标记的探针相结合。

然后由激光器激发荧光基团发光，不同荧光基团所发射的光信号被相机采集，经过处理后转换成数字信号，传输到计算机进行处理，可以获取待测样本的碱基序列信息。

（5）2.5代测序技术/半导体测序技术：半导体测序技术由Ion Torrent研制开发。由于使用到了Emusion PCR技术，其实质介于二代和三代测序技术之间。

该技术使用一种高密度半导体芯片，每个芯片单独的进行测序。

实验时先将芯片置于一个离子敏感层和离子感受器之上，当DNA聚合酶在每一个单分子模板链上滑动时，发生聚合反应，释放出氢离子，最终离子感受器就会捕捉到这种信号，从而读出DNA序列。


三代测序技术


常见测序技术与平台

单分子荧光测序技术

美国Helicos BioSciences公司的SMS技术

美国Pacific Bioscience公司的SMRT技术

纳米孔测序技术

英国Oxford Nanopore Technologies公司

电子显微镜观察法

美国ZS Genetics公司

美国Electron Optica公司


（1）单分子荧光测序技术：代表是美国螺旋生物（Helicos BioSciences）（该司已停止营业）的SMS技术和美国太平洋生物（Pacific Bioscience）的SMRT技术。其通过将脱氧核苷酸用荧光标记，实时地记录荧光的强度变化。当荧光基团被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

测序过程包括文库构建和上机两步。文库构建是将长片段DNA分子与测序接头连接成茎环结构，然后加上与接头互补的测序引物及DNA聚合酶。上机测序是将构建好的文库复合物载入SMRT Cell的纳米孔中，通常一个纳米孔固定一个DNA分子，DNA聚合酶通过共价连接的方式固定在纳米孔底部。

（2）纳米孔测序技术：Nanopore测序是基于电学的检测，区别与Illumina和PacBio的光学。

代表是英国牛津纳米孔（Oxford Nanopore Technologies，ONT）公司。新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。

由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，四种核苷酸的空间构象不一样，因此当它们通过纳米孔时，所引起的电流变化不一样。由多个核苷酸组成的DNA或RNA链通过纳米孔时，检测通过纳米孔电流的强度变化，即可得到碱基序列。

纳米孔测序仪MinION是现在最便携的测序仪，最小的版本和人的手掌差不多大，可以直接插在电脑上进行使用。ONT公司将MinION称之为世界上唯一的实时（real-time）测序仪。判断通过纳米孔的核苷酸类型，从而进行实时测序。

（3）电子显微镜观察法：2012年，首次报道通过电子显微镜鉴定完整DNA分子的碱基结构。

ZS Genetics（该司已停止营业）使用透射电子显微镜(TEM)通过检测标记的重金属标签观测DNA分子，但当重金属标签相距较近时很难分辨并会相互影响，而且透射电子显微镜发射的高能电子束易破坏DNA分子结构。

Electron Optica公司使用低能量电子显微镜LEEM，可以减少对DNA分子结构的破坏，且不使用重金属标签，在测序时发生的错误较少，但获得的图片分辨率低。


各代测序技术的优缺点

一代测序

优点：方法简便，分辨率高，测序片段长，流程细致，质控环节多，污染低，结果直观可视，假性结果极低。在单个基因测序方面具有优势。金标准。

缺点：测序试剂昂贵，通量低，处理比较长的同聚物时也有自身的问题。

二代测序

优点：通量高，一次可对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定；单条序列成本低。

缺点：序列读长短；建库过程中有PCR过程，会引入错配碱基；要想得到准确和长度较长的拼接结果，需要较高的测序覆盖率，会增加成本和错误率。

三代测序

优点：

连贯性：连贯性对基因组的组装非常重要，如果连贯性比较好，能够准确的反应出基因结构之间的关系（外显子、基因簇、转移元件、调节序列等）。

完整性：如果一个基因组的测序深度>50X，理论上每一个碱基都会被测到。但实际上，基因组仍然会有很多缺失区域，比如即便是最新的人类参考基因组，其中仍然会有超过百万的“N”。读长的提升能够有效提高基因组组装的完整性。

准确性：基因组组装的准确性可以在核酸水平或者结构变异水平进行描述。Illumina的三代测序技术的准确性非常高，每个碱基准确性大于99.9%，PacBio和Nanopore的准确性在足够测序深度的情况下，经过算法校正之后也能够达到99.9%。

缺点：单读长的错误率偏高，需要重复测序以纠错；依赖DNA聚合酶的活性；成本较高；生信分析软件不够丰富，数据积累少。

纳米孔测序

优点：

超高的便携性，MinION可以做到即插即用，非常适合流行病疫区的即时检测；

超长的读长，MinION可以达到150kb，可用来填补之前测序的gap，可用于从头组装基因组，可变剪切等；

广泛的应用，可以直接对DNA，RNA和蛋白质序列进行测序；碱基判读准确率较高，R10纳米孔数据质量值超过Q40（即错误识别的概率是0.01%，即错误率0.01%），一致性（Identity）质量值达Q50 (99.999%的碱基准确率)。

缺点：低准确度，尤其是2D reads，虽然可以通过降低DNA通过速度或一致性检测提高准确度，但仍无法和二代测序相比


总结与展望

2004年至2010年间的测序能力每五个月翻一番，测序成本以超摩尔定律下降。

测序成本以超摩尔定律下降

未来测序将更加专一化，具有更高的通量，测序设备微型化、高度集成，测序数据分析能力进一步提高，测序对象范围扩展，测序成本更低。测序技术以及平台的研究还有很多问题需要解决，相信未来在各应用领域将对人类产生更大的作用。


References:

Heather JM, Chain B. The sequence of sequencers: The history of sequencing DNA. Genomics. 2016 Jan;107(1):1-8.

Topol EJ. Individualized medicine from prewomb to tomb. Cell. 2014 Mar 27;157(1):241-53. doi: 10.1016/j.cell.2014.02.012.

Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid

https://www.jianshu.com/p/926d02f94c78

https://blog.csdn.net/u010608296/article/details/111475760

https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Sequencing-Human-Genome-cost#:~:text=Based%20on%20the%20data%20collected%20from%20NHGRI-funded%20genome-sequencing,generate%20a%20whole-exome%20sequence%20was%20generally%20below%20%241%2C000.

https://ibook.antpedia.com/x/477335.html