通过 CRISPR-Cas9 进行的基因编辑在生物和医学科学领域具有广泛的潜力,但目前的技术在插入大片段 DNA 序列方面的效果有限。

近日,来自麻省理工学院的研究员 Omar Abudayyeh、Jonathan Gootenberg 及其同事开发了一种称为 PASTE 的技术,该技术有可能用于插入长链 DNA 并治疗由具有大量突变的缺陷基因引起的疾病,例如囊性纤维化和 Leber 先天性黑蒙症,后者是一种导致失明的罕见眼病。相关研究以题为“Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases”发表于 Nature Biotechnology 期刊。

Gootenberg 和 Abudayyeh 是这项新研究的通讯作者,该研究的主要作者是麻省理工学院技术助理 Matthew Yarnall 和 Rohan Krajeski、麻省理工学院研究生 Cian Schmitt-Ulms 等。

Omar Abudayyeh 和 Jonathan Gootenberg 是张锋的学生,现在两人都是麻省理工学院麦戈文脑科学研究所的研究员。毕业后,两人在麦戈文脑科学研究所共同成立了实验室 Abudayyeh-Gootenberg Lab。实验室的主要研究方向是构建和应用下一代分子工具。即将生物学发现和分子工程相结合,开发一套用于操作 DNA、RNA 和细胞状态的新工具——细胞工程工具箱,并将这些工具应用于调控细胞命运、衰老以及遗传疾病。

根据研究,通过 PASTE,研究人员可以在他们想要的位置插入长达 36,000 个碱基对的序列。


可定点插入长达 36000 个碱基对的序列

通过 CRISPR-Cas9 系统将感兴趣的序列整合到细胞的基因组 DNA 中需要 Cas9 让双链断裂,并激活细胞的同源定向修复 (HDR) 通路以响应破坏,便于序列整合。然而,在大多数细胞和细胞周期的阶段中,非 HDR 途径(例如非同源末端连接)占主导地位;在非分裂细胞中,HDR 大部分处于非活动状态,使得有效整合几乎不可能。此外,所有基于 DNA 双链断裂修复的方法都容易出错,导致插入或缺失、DNA 易位和细胞凋亡途径的激活等。

2019 年,Prime Editing 的开发将基因编辑提升到了一个新的水平,这种方式允许引入所有突变类型,包括插入、缺失等。Prime Editing 在 Cas9 酶和 gRNA 两方面进行了改造:将 Cas9 酶的变体与逆转录酶融合,形成融合蛋白复合体;在 gRNA 3'末端增加了一段 RNA 序列,形成所谓的 pegRNA。

之后,刘如谦将 Prime Editing 进行了优化,升级为 twinPE(twin Prime Editing)。它使用 2 个 pegRNA 序列,与标准的 prime 编辑相比,后者提高了效率并增加了插入、删除、倒置、替换的大小。该团队还将 twinPE 与丝氨酸整合酶 Bxb1 相结合以插入 5kb 序列,并使用组合技术介导导致亨特综合征的基因发生 40kb 倒位。

基于上述研究,刘如谦创办了 Prime Medicine 公司,该公司也于一个月前登陆纳斯达克。目前,Prime Medicine 共有 18 个临床前研发管线,针对肝脏、离体造血干细胞、眼睛、耳、神经肌肉系统、肺等多个器官和组织,递送载体包括 AAV、LNP,以及其他非病毒载体。

在此次研究中,研究人员将 Prime Editing 的功能与整合酶的序列特异性整合能力相结合。他们将丝氨酸整合酶 Bxb1 与现有的 Cas9 切口酶和逆转录酶融合。丝氨酸整合酶可以插入大片段 DNA,长达 50,000 个碱基对。

(来源:上述论文)

组合技术背后的想法是,整合酶本身不容易被设计为插入到除其特定目标序列之外的任何位置,但它们能够携带大序列。与此同时,可以设计 Prime 编辑器来靶向和编辑特定位点,但仅限于刚好足以插入整合酶的目标序列。

据 Abudayyeh 表示,与目前的基因编辑方法不同,后者只能同时追踪一种疾病的单个突变,PASTE 可以通过替换整个基因同时解决许多突变。此外,该技术不会在 DNA 中产生双链断裂,从而降低了不需要的插入或删除的风险。

事实证明,通过在 PASTE 中结合两者,研究人员可以在他们想要的位置插入多达 36,000 个碱基对的序列。

但刘如谦也在一封邮件中指出,“在我们实验室,主要编辑器-重组酶融合的平均效果并不比简单地将重组酶表达为单独的蛋白质更好,而且在某些情况下,融合的效率低于单独表达的蛋白质。”

宾夕法尼亚大学教授兼 Verve Therapeutics 联合创始人 Kiran Musunuru 和哥伦比亚大学教授兼 Prime Medicine 的顾问 Sam Sternberg 都表示,他们认为两者相似。“有很大区别吗?我认为无论是两种不同的蛋白质分别制造还是单一蛋白质都没有太大关系,他们似乎都工作得相当好。”Musunuru 表示。


相关技术已授权公司

在这项研究中,研究人员表明他们可以使用 PASTE 将基因插入多种类型的人类细胞,包括肝细胞、T 细胞和淋巴母细胞(未成熟的白细胞)。他们使用 13 种不同的有效载荷基因(包括一些可能具有治疗作用的基因)测试了递送系统,并能够将它们插入基因组的 9 个不同位置。

在这些细胞中,研究人员能够以 5% 到 60% 的成功率插入基因。但这种方法在基因整合位点产生了极少不需要的插入或缺失。“我们看到的插入缺失很少,而且因为我们没有制造双链断裂,所以不必担心染色体重排或大规模染色体臂缺失。”Abudayyeh 说。

研究人员还证明,他们可以将基因插入小鼠的“人源化”肝脏中。这些小鼠的肝脏由大约 70% 的人类肝细胞组成,PASTE 成功地将新基因整合到大约 2.5% 的上述细胞中。

研究人员现在正在进一步探索使用该工具作为替代有缺陷的囊性纤维化基因的方法的可能性。该技术还可用于治疗由缺陷基因引起的血液疾病,例如血友病和 G6PD 缺陷,或亨廷顿氏病,这是一种由具有过多基因重复的缺陷基因引起的神经系统疾病。

目前,这项技术已经授权给 Tome Biosciences,一家由 Omar Abudayyeh 和 Jonathan Gootenberg 于 2021 年 2 月共同创立的生物技术公司,并得到 ARCH、a16z、Longwood Fund、Polaris Partners 和 Alexandria Ventures 的支持。根据美国证券交易委员会 4 月份提交的一份文件,Sana Biotechnology 也持有该公司的股份,该公司是一家成立于 2018 年的细胞和基因疗法公司,目前已在纳斯达克挂牌上市。

▲图 | Tome Biosciences 融资情况 (来源:CB Insights)

值得注意的是,Tome Biosciences 没有 Prime Medicine 的许可,Prime Medicine 的一位发言人告诉外媒,目前还没有就此进行谈判。

Abudayyeh 和 Gootenberg 强调,虽然他们在论文中使用了 Prime Editing,但更通用的 PASTE 框架并不局限于 Prime Editing。“Prime 就是一个例子,但不是唯一的方法。”Gootenberg 称。

目前,Tome Biosciences 公司并无过多信息披露,这家总部位于马萨诸塞州沃特敦的生物技术公司由首席执行官 Rahul Kakkar 领导,截至今年第三季度拥有 80 多名全职员工。Tome 方透露希望到 2026 年有管线进入临床进入临床。