王开乐，是美国得克萨斯大学安德森癌症中心的助理教授。近日，他和合作者研发一款高通量单细胞 DNA 测序方法——“Arc-well”。

图 | 王开乐（来源：王开乐）

这是第一个能对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE，Formalin-Fixed Paraffin-Embedded）组织进行测序的方法，能同时对数千个细胞进行基因拷贝数进行分析，填补了利用单细胞 DNA 测序对 FFPE 样本进行大规模基因组分析的空白，使得存放几十年的 FFPE 样本得以重见天日。

借助这一方法，该团队针对原发原位导管乳腺癌（DCIS，ductal carcinoma in situ）和复发 DCIS 和浸润性乳腺癌样本进行系统性研究，借此揭示了从原发 DCIS 到复发癌症所遵循的演化模型，为治疗原发 DCIS 提供了重要参考。

从技术层面来讲，Arc-well 方法不仅适用于乳腺癌样本，也适用于其他癌症。该团队利用 Arc-well 对肺癌、前列腺癌、结肠癌、食道癌、卵巢癌等其他多种癌症进行了单细胞 DNA 测序，都获得了非常稳定可靠的结果。

尽管 Arc-well 方法主要针对 FFPE 样本，但其同样适用于新鲜组织和冰冻组织。在新鲜组织和冰冻组织中，由于 DNA 保存得更好、更完整，因此还能检测这些样本中所存在的 DNA 点突变和小的插入缺失等。

当然，Arc-well 也可用于其他不同物种之中，比如常见的模式生物小鼠、大鼠、灵长类等等。经过一定优化，Arc-well 也可以在植物和海洋生物上产生巨大应用前景。另外，还可尝试用于研究博物馆中存放几十年甚至上百年的动物组织样本。

整体来看，在乳腺癌治疗层面，本方法鉴定了来源于原发癌症之中的残留克隆，并发现了可能和乳腺癌复发相关的一系列基因组变异事件。这说明在特定的样本之中，原发性的癌症克隆并没有被手术彻底清除掉。对于这类患者来说，还需要结合其他治疗方案加以进一步处理。

而此次鉴定的和复发相关的基因组事件，也可作为相关治疗方案的参考靶点。同时，也能为研究乳腺癌复发提供目标和思路。另外，同样的思路也可用来研究其他癌症的原发、复发和转移等。

（来源：Cell）


01

分析 10 位病人的 20 个匹配样本

DCIS 是侵润性乳腺癌的常见前体，通常在乳腺 X 射线筛查期间被检测到。在大约 20% 的患者中，即使经过手术和放疗等局部治疗，DCIS 也可能会在 15 年内复发或发展为侵润性疾病。

然而，对于原发 DCIS 病变是否与复发的 DCIS 或侵润性导管癌存在直接基因谱系关系？DCIS 的克隆多样性及其如何演化为复发疾病？复发疾病中是否存在来源于原发 DCIS 的残留癌细胞克隆？以及哪些基因或者拷贝数事件跟复发相关等这些关键问题仍然没有很好的解决。

为解决这些问题，该课题组与荷兰癌症研究中心、以及美国杜克大学的研究团队合作，针对所收集的来自 10 位病人的原发 DCIS、以及来自 2-16 年后复发 DCIS 病人的 20 个样本进行了 Arc-well 测序，借此全面分析了 DCIS 样本和复发样本中基因拷贝数的变异情况。

他们发现原发 DCIS 样本具有与复发样本相当的基因组异质性，且绝大多数样本已经经历了全基因组倍增事件。进一步通过基因组谱系演化分析他们发现：在所有的 10 个样本中，复发癌症都跟原发 DCIS 存在直接的谱系关系，且绝大多数复发样本是由原发 DCIS 经历演化瓶颈之后逐步发展而成，只有少数样本经历了多克隆演化的模型。同时，他们鉴定了与复发相关的基因组变异事件。

（来源：Cell）


02

聚焦于研究乳腺癌的演化和发展

乳腺癌的演化和发展，一直是王开乐所在实验室的研究重点。早在 2016 年，该团队就着手开发新一代单细胞 DNA 测序技术，并从最初的几十个细胞做到几百个细胞。

但是，如此低的通量对于研究 FFPE 的 DCIS 样本是远远不够的。因为 DCIS 是相对早期的乳腺癌，在这些癌症样本之中存在大量的正常细胞，包含上皮细胞、基质细胞和免疫细胞等。而在这些二倍体细胞之中，很有可能含有少数基因组变异的癌细胞。因此，在对 DCIS 进行测序时，需要同时对来自二倍体和多倍体的细胞同时进行测序。

另外，由于样本来源于 FFPE，因此在解离单细胞的过程中，会产生很多不完整的细胞。同时，由于样本的长时间储存，还会有大量 DNA 降解的细胞。

因此，只有高通量的、稳定性极高的单细胞测序方法，才能有效地对 FFPE 样本进行基因组分析。

意识到这一问题之后，王开乐便着手开发 Arc-well。他从新鲜细胞系入手，从使用单个 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）管进行手动测试，到使用超声液体加样仪对几百个单细胞进行测试，最后使用纳升体系开展芯片测试。

随后，他们又测试了由福尔马林固定的细胞系、新鲜制备的 FFPE 样本、以及已被保存多年的 FFPE 样本。期间，他们还测试了不同的 FFPE 单细胞解离方案和 FFPE 样本修复方案等。

2019 年，该团队完成了实验方法的开发和优化。同年，他们开始和荷兰癌症研究中心以及美国杜克大学的研究团队合作，收集配对的原发 DCIS 和复发乳腺癌样本。一直到 2022 年初完成了所有的实验、数据分析、以及论文的撰写。

最终，相关论文以《存档的单细胞基因组学揭示了 DCIS 进展过程中的残留亚克隆》（Archival single-cell genomics reveals persistent subclones during DCIS progression）为题发在 Cell[1]，王开乐是第一作者，美国得克萨斯大学安德森癌症中心尼古拉斯·E·纳文（Nicholas E. Navin）担任通讯作者。

图 | 相关论文（来源：Cell）

Arc-well 使得对 FFPE 样本进行高通量单细胞 DNA 测序成为可能，虽然该研究主要聚焦于拷贝数变异事件，但他们也在拓展该方法在 DNA 单碱基突变检测方面等的应用，并逐步提高这一方法的通量和分辨率，以及降低该方法的成本。

同时他们正在对更大规模的乳腺癌原发和复发样本进行单细胞测序，借此确定跟复发相关的基因组变异事件。另外，针对存在于复发癌症中的、来源于原发 DCIS 的癌症克隆空间定位及其微环境，课题组也非常感兴趣。


03

充满人生变革，尝遍酸甜苦辣

整个研究耗时将近 6 年，他说：“这 6 年，我在工作和生活上都经历了很多事，可谓尝遍了酸甜苦辣。”

工作上，他花了将近一年试图重复他人方法来研究自己的课题，结果发现数据基本不可用，于是不得不放弃。而他自己设计的方法明明原理上行得通，但是尝试了几十上百次依然不成功。

他说：“明明简单得不行，但在一开始就是怎么也做不出来。后来发现原因之后，通过简单的错开时间就解决了问题。”

此外，他也曾为博后前几年没有任何产出而饱受折磨与煎熬。

幸运的是，他所设计的各种方法都开始慢慢有起色，实验室成员之间也都能相互合作，最终让论文得以顺利发表。

其还表示：“期间我的生活也发生了巨大变化。我痛失了我挚爱的、曾给予我一切的、养我、教我的父亲。自己也开始从之前的为人子变成了为人父。娃的到来，给工作和生活都带了前所未有的挑战，但也带来许多幸福和美好的瞬间。尽管一路走来步履维艰，幸运的是一直有家人的支持。”

据介绍，王开乐是山东费县人。他的父亲是一名木匠，平时喜欢钻研东西。受父亲的熏陶，他也喜欢开发新方法和新东西。因此，在王开乐的绝大多数工作中，他都是通过开发新方法去解决有趣的生物学问题。

王开乐本科毕业于中南民族大学。他表示：“我考研还是蛮波折的，当时报考的第一单位只招收一人，最后辗转调剂到中国科学院北京基因组所。那时我的导师吴仲义刚从芝加哥大学回国担任基因组所所长，正好组里有名额，我就有幸成为了吴老师的学生。”

他继续说道：“可以说正是吴老师的收留改变了我的一生。吴老师是个非常纯粹的科学家，对学生很是开放和宽容。他总是有很多有意思的科学问题，而当时最吸引我的就是检测人体正常体细胞存在的突变。”

但是，由于当时高通量测序存在 0.1%-1% 的错误率，而正常人体中 DNA 突变的水平远远低于此，因此必须研发新的方法去解决这些难题。

从那开始，王开乐就踏上了低频突变检测之路。刚开始他设计了一种方法：利用 Tn5 转座子将带有分子标签的序列，加入目标 DNA 分子两端。结果由于当时的测序成本等问题，这一方法最终没能成行。然而正是从此开始，他开始学习设计不同的分子生物学方法，也让他找到了自己喜欢的方向。

后来，在中国农科院研究员阮珏老师的指导之下，他们提出了一种利用串联重复体相互矫正来降低 DNA 测序错误的思路。通过这一方法他们获得了比传统方法高出两个数量级的精准度。

王开乐说：“科学研究有时也伴随着惊喜，我在读博期间设计了一种双切口的双链环状结构来控制 DNA 滚坏扩展的倍数。但是我做了很久都没有任何进展。

就在临近博士毕业时，我突然想明白关键所在，于是稍微修改下设计方案，结果一下就做成了。那种苦思而不得解、突然柳暗花明的感觉特别美妙。”

后来，他在博士毕业之后来到美国得克萨斯大学安德森癌症中心进行博士后研究。在这里，他设计开发了一种可以对单细胞进行样本和空间标记的方法，开发了本次论文提到的能适用于 FFPE 组织的高通量单细胞 DNA 测序方法、还有其他一些尚未发表的单细胞测序方法。

其表示：“开发设计新的单细胞测序方法，就如木匠做一套新的家具，都需要精心的设计和计算，然后通过不停地尝试去验证。虽然摸索的过程比较辛苦，但也不乏跌宕起伏，而每一点进展也都让人激动不已。新的方法往往给研究的问题带来新的视角，那种第一次看到别人从来没有看到过的东西的感觉特别美妙。”


参考资料：

1.Wang, K., Kumar, T., Wang, J., Minussi, D. C., Sei, E., Li, J., ... & Navin, N. E. (2023). Archival single-cell genomics reveals persistent subclones during DCIS progression. Cell, 186(18), 3968-3982.