华大基因新技术！蛋白-DNA交互作用迎来重要突破

编辑:中国基因网发布于:基因研究2023-04-066247

3月29日，华大基因（300676）唐冲博士团队于基因组学顶级期刊Genome Biology发表重要科学论文“BIND&MODIFY: a long-range method for single-molecule mapping of chromatin modifications in eukaryotes”。

文章发表于Genome Biology

该文章介绍了一种基于构建葡萄球菌蛋白A-甲基转移酶融合重组蛋白，对抗体结合的组蛋白修饰、DNA结合蛋白附近的DNA进行特异性定点甲基化修饰，并通过长读长测序获得高精度的、DNA单分子水平上的组蛋白修饰及DNA结合蛋白序列信息。

ChIP-seq、CUT&Tag等都是常见的研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，传统的基于ChIP-seq的蛋白-DNA互作研究方法，利用抗体免疫沉淀后富集的打断后DNA片段短读长测序并进行peak calling，反映了特定DNA位点的蛋白结合平均状态信息。但这些传统方法无法获得每一个大片段DNA分子上蛋白结合的真实状态，无法进行DNA复杂结构域蛋白-DNA交互作用的分析，使得蛋白-DNA交互作用在单分子水平上的研究受到限制。

本技术通过对不打断的大片段DNA分子进行特异性甲基化标记，利用长读长测序，获得高精度、DNA单分子水平上的组蛋白修饰、DNA结合蛋白序列信息，同时获得DNA单分子异质性、CpG甲基化多组学、复杂结构域的蛋白-DNA互作等信息。

该研究结果的发布，吸引了业界广泛关注。今天，我们特邀华大基因该项目第一作者瓮喆博士，为我们详细解析这项新技术。

该研究有哪些主要成果？

本方法（BIND&MODIFY）首先构建了一种葡萄球菌蛋白A-甲基转移酶融合蛋白（pA-M.EcoGII），将针对组蛋白修饰、DNA结合蛋白特定抗体与细胞孵育后，pA-M.EcoGII与特异性抗体结合。

随后，激活甲基转移酶活性，将抗体结合蛋白附近的DNA序列中的腺嘌呤（adenine）高效率转化为N6-methyladenosine （m6A）。

最后，通过纳米孔单分子长读长测序对m6A位点进行检测，获得单分子水平的高精度蛋白-DNA结合位点信息（图1）。

图1 BIND&MODIFY技术路线流程图

进一步地，通过与传统ChIP-seq对标，本方法在检测组蛋白修饰H3K27me3水平上，具有接近的趋势、较高的相关性、以及相近的精度（图2）。在染色质复杂结构域pericentromeres区域，本方法具有优于短读长测序的检验精度。

图2 BIND&MODIFY与传统ChIP-seq相比，具有高度相关性

通过分析结合位点转录起始位点（TSS）上游1000-0bp的m6A比率，本方法能够进行DNA分子聚类（图3），通过gene ontology分析，发现异质性较高的DNA分子（cluster 3）与乳腺癌相关通路相关，如VEGF singling pathway、B cell receptor signaling pathway、PD-L1 checkpoint pathway等。本方法首次实现了单分子水平上的基于组蛋白修饰H3K27me3的DNA异质性鉴定。

图3 BIND&MODIFY实现DNA分子在蛋白-DNA结合水平上的异质性鉴定

最终，本方法通过对大片段DNA分子上的蛋白-DNA交互作用相关性进行分析，构建了反映DNA分子上蛋白-DNA作用相关性的co-labeling coefficient (CC)分析方法，以及反映分子上蛋白-DNA作用强度的cc index分析方法（图4），实现了组蛋白修饰H3K27me3与DNA结合蛋白CTCF在单分子水平上的远端作用相关性检测。