编者按

Cas12a2是一种CRISPR相关核酸酶，在识别互补RNA靶标后，对单链RNA、单链DNA和双链DNA进行RNA引导、序列非特异性降解，最终导致流产感染。

2023年1月4日，美国德克萨斯大学奥斯汀分校分子生物科学系David W. Taylor研究组与美国犹他州立大学化学与生物化学系Ryan N. Jackson研究组合作在Nature 杂志在线发表题为“RNA targeting unleashes indiscriminate nuclease activity of CRISPR–Cas12a2”的研究论文，该研究报道了Cas12a2的二元、三元和四元配合物结构，揭示了一个完整的激活途径。结构表明，Cas12a2是自抑制的，直到结合同源RNA靶标，从而暴露出一个大的带正电荷的裂缝中的RuvC活性位点。双链DNA底物通过双扭曲和局部熔化被捕获，由对双链DNA降解和体内免疫系统功能至关重要的“芳香钳”残基对稳定。

总之，这项工作为这种流产感染机制提供了结构基础，以实现人群水平的免疫，可以利用它来创造合理的突变体，从而降解一系列的附带底物。

另外，2023年1月4日，德国Helmholtz研究所Chase L. Beisel、美国犹他州立大学化学与生物化学系Ryan N. Jackson与美国本森山Matthew B. Begemann合作在Nature杂志在线发表题为“Cas12a2 elicits abortive infection through RNA-triggered destruction of dsDNA”的研究论文，该研究报道了V型单效应核酸酶Cas12a2的RNA靶向通过双链DNA (dsDNA)的非特异性切割驱动流产感染。Cas12a2识别出具有激活原间隔区侧翼序列的RNA靶标后，可以有效降解单链RNA (ssRNA)、单链DNA (ssDNA)和dsDNA。在细胞内，Cas12a2的激活诱导SOS DNA损伤反应并损害生长，阻止入侵者的传播。最后，利用Cas12a2的侧枝活性进行直接RNA检测，证明Cas12a2可以被重新利用为RNA引导的RNA靶向工具。总之，这些发现扩展了CRISPR - Cas系统的已知防御能力，并为CRISPR技术创造了额外的机会。

原核适应性免疫通常使用CRISPR-Cas系统靶向和降解外源遗传元件，包括噬菌体和质粒。然而，最近发现来自Sulfuricurvum sp. PC08-66的Cas12a2反而依赖于流产感染——即休眠或细胞死亡以应对入侵者的存在——来实现群体水平的免疫，阻止质粒的复制和传播。

Cas12a2有时在细菌中与Cas12a系统共存，并且可以使用Cas12a CRISPR RNA (crRNA)， Cas12a2识别具有合适的原间隔区侧翼序列(PFS;例如，5 ' -GAAAG-3 ')而不是Cas12a的双链(double-stranded，ds)DNA靶标。此外，Cas12a2对许多靶向Cas12a的抗CRISPR蛋白的作用免疫，并且除了保守的RuvC核酸酶结构域和pre-crRNA加工区域外，Cas12a和Cas12a2序列几乎没有相似之处(大约10-20%的序列相同)。值得注意的是，Cas12a2缺乏一个Nuc结构域(参与DNA靶链加载)，而是含有一个锌带(zinc ribbon，ZR)，它含有一个独特的插入结构域来代替Cas12a桥螺旋。

与许多最近被描述为流产感染的系统不同，Cas12a2不依赖于二级信使的产生来实现抗噬菌体免疫。相反，Cas12a2的激活诱导了反式中单链(single-stranded，ss)RNA、ssDNA和dsDNA1的强健的非特异性切割。这种机制是Cas12a2所独有的，尽管侧支核酸降解的分子基础尚不清楚。

为了了解Cas12a2功能下的激活、底物捕获和任意核酸酶活性的独特机制，该研究进行了生化、结构和体内分析，包括测定与RNA靶标(三元复合物)相关的自抑制Cas12a2 - crRNA(二元复合物)的冷冻电子显微镜结构，并与RNA靶标和dsDNA副底物模拟物(四元复合物)结合。

图1. Cas12a2二元复合体类似牡蛎，排列crRNA（图源自Nature ）

研究表明crRNA与含PFS的RNA靶标的杂交驱动Cas12a2的主要构象变化，暴露RuvC活性位点并缓解自抑制。在活性复合体中，RuvC结构域位于约30-Å-wide带正电荷的槽内，该槽足够大，可容纳双工核酸。非特异性静电相互作用促进侧基捕获，伴随双工畸变和局部碱基对熔化。熔化的碱基由两对芳香钳稳定，使单个核酸链在RuvC活性位点内的适当定位。这种多次翻转DNA切割最终导致dsDNA降解，不同于Cas12a或Cas9的单次翻转dsDNA切割，并能在体内实现强大和广泛的DNA破坏。

图2. Cas12a2 RNA靶点激活侧支核酸酶活性的机制（图源自Nature ）

总的来说，这项研究发现的Cas12a2(Y1069A)点突变体可以切割ssDNA，但不能切割dsDNA或ssRNA，这为一种具有间接活性的RNA传感器提供了蓝图，这种传感器不会破坏被编程检测的RNA目标，也不会被样本中过量的其他RNA分散注意力，这可能会使高灵敏度RNA诊断的发展成为可能。


原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-022-05560-w

https://www.nature.com/articles/s41586-022-05559-3