在传统克隆中，最让人头疼的一个方面就是选择和鉴定含有正确克隆质粒的单克隆。利用致死基因（ccdb）筛去不含插入序列的载体可以让筛选变得更简单。但是ccdb如何实现该功能的呢？下面让我们了解一下该基因的简介及科学家们如何利用他特有的性质来发展克隆技术。


致死基因的作用机理

在一部分大肠杆菌的遗传物质上有一段被称为致死基因（CCDB）的序列，是毒性-抗毒性系统中被致死基因编码的操纵子的一部分，确保含F质粒可以随着细胞分裂而遗传下去。致死基因编码的有毒性的蛋白，是一种螺旋酶抑制剂，锁定已经断裂的DNA复合物和螺旋酶，使螺旋酶不能发挥作用，最终导致细胞死亡。CCDA是CCD系统操纵子中的另一个基因，作用是可以编码抗毒性蛋白CCDA，保护细胞免受CCDB的毒性作用。细胞因为无法进一步遗传F质粒而失去了CCDA基因，导致致死基因编码毒性蛋白把细胞致死。


F质粒的寄主致死体系

F质粒的寄主致死体系主要由其基因组中控制致死功能的基因CCDA和CCDB负责。在含该质粒的细胞中，CCDA蛋白作为解毒剂专门与毒剂CCDB蛋白结合，并使之失效。

在新产生的无质粒的子细胞中，开始的适合是含有CCDA和CCDB两种蛋白的。但由于毒剂CCDB和解毒剂CCDA具有不同的稳定性，CCDA蛋白质不稳定，易被蛋白酶降解，而较稳定的CCDB蛋白质便可行使其对寄生虫细胞的致死作用。


致死基因在克隆中的作用

很多年前分子生物学家们发现了CCDB系统在提高克隆效率方面的潜力并且发展出运用该系统的克隆载体，如pTALEN-v2和pDONR223等。这些质粒上被编码一个致死基因，克隆片段插入到该基因中的MCS则扰乱该致死基因的表达，理论上可以使存活的菌落均含成功克隆的质粒，例如CCDB基因系统。这和蓝白斑筛选中肽的DNA干扰相似。抗生素选择同样被与之结合使用以确保阳性菌落中含有质粒。因此可以显著降低不含重组质粒的菌落数量，使筛选过程更简单、克隆过程更高效。

Gateway技术（由Invitrogen开发）是旧系统的更现代化更有潜力的版本。Gateway利用了CCDB基因，其质粒中含有CCDB基因，当表达该基因时，细胞不能繁殖。成功克隆后，插入片段完全取代了CCDB基因，不含插入片段的菌落不能生长繁殖，因此可以高效的鉴定正确的克隆。


可以“解毒”的大肠杆菌

CCDB基因中的一个关键的问题是这个表达后即能杀死细胞的质粒是如何转化的呢？这就要归功于一种于能耐受该毒性基因的大肠杆菌的菌株。如DB3.1就可以耐受CCDB的毒性作用可以保存质粒而用于后续克隆实验。