CRISPR/Cas基因编辑技术已广泛应用于植物基础生物学研究，并为作物精准改良提供了前所未有的机遇。然而，CRISPR/Cas元件高效递送方法的缺乏，以及编辑植株再生所面临的技术困难，是制约这些革命性技术在农业中广泛应用的主要技术瓶颈。虽然核酸酶分子工具仅需短暂地存在于细胞内便可完成靶向基因修饰，但由于植物细胞壁结构的阻碍，当前通常依赖于稳定整合的转基因进行植物递送。稳定转化仅对有限数量的作物物种及品种有效，且技术门槛高、转基因分离周期长、对植物基因组和表观组存在潜在影响，这些问题一直困扰着从事植物分子生物学和育种工作的研究人员。

作为天然的基因递送纳米材料，病毒载体受到广泛的关注。然而，目前普遍使用的CRISPR/Cas核酸酶及衍生分子的编码序列长度远超出绝大多数植物病毒载体的承载上限（ 1-2 kb）。2020年，李正和课题组利用一种负链RNA弹状病毒—苦苣菜黄网病毒，首次报道了病毒载体在植物中系统递送完整CRISPR/Cas组份，并在模式植物本氏烟上实现了高效基因编辑（Ma et al., Nat Plants, 2020, 6, 773-779）。遗憾的是，由于狭窄的寄主范围及其它病毒学问题，该病毒载体未能在作物中得到广泛应用。

2023年2月7日，浙江大学农业与生物技术学院李正和课题组在Molecular Plant 发表题为“Engineered biocontainable RNA virus vectors for non-transgenic genome editing across crop species and genotypes”的研究论文。文章报道了基于一种广寄主范围的番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）建立的瞬时递送系统，可用于向多种作物不同品种稳定递送一系列大的CRISPR/Cas核酸酶分子。研究者建立了通过组织培养高效产生含有可遗传突变植物的技术流程，并结合抗病毒化学治疗脱除病毒载体。该研究开发的病毒递送系统为众多作物的基因组编辑提供了一种有前途的解决方案。

https://doi.org/10.1016/j.molp.2023.02.003

TSWV为一种负链、分节段、双义编码的RNA病毒，是已知寄主范围最为广泛的植物病毒，可侵染84个科、1000多种单子叶或双子叶植物，包括多种蔬菜、花卉、油料、纤维、药用植物及野生近缘种。首先，研究者建立了高效的TSWV遗传操作系统，结合病毒结构和复制特点，通过对病毒基因组进行解构，删除了对侵染植物寄主非必要的病毒基因元件，为搭载外源序列释放了病毒基因组空间。利用该策略，研究者实现了CRISPR/Cas12a (Cpf1)、CRISPR/Cas9、乃至分子量更大的腺嘌呤、胞嘧啶碱基编辑器的病毒递送，该载体还可携带一个荧光报告基因以示踪病毒侵染，并可通过串联表达多个向导RNA实现高效的多重基因编辑（图1）。

图1. TSWV核酸酶递送载体设计和基因编辑分析

经多次连续传代后，重组病毒携带的外源基因依然保持完整且编辑能力未发生改变，证明了其杰出的货物承载能力和基因组稳定性。值得指出的是，由于缺失了糖蛋白基因，重组病毒载体从原来的球形包膜粒子形态转变为不定形核衣壳结构，无法被其介体昆虫西花蓟马获取和传播，避免了遗传修饰病毒的实验室意外逃逸，具有生物可控（biocontainable）特性。

在实验条件下，TSWV可经简单的汁液摩擦接种侵染寄主植株。研究者将病毒载体接种普通烟、番茄、一年生辣椒(Capsicum annuum)、中华辣椒(C. chinense)、灌木状辣椒(C. frutescens)、花生和酸浆（灯笼果）等寄主植物，在相应靶标处检测到了高频率的基因突变和碱基转换。进一步对辣椒和花生各10个商业品种进行了测试，证实TSWV载体以非基因型依赖的方式适用于多种作物和基因型的核酸酶递送和体细胞基因编辑（图2）。

图2. TSWV核酸酶递送系统对不同作物和品种的适用性分析

为了获得可遗传的编辑植株，研究人员以病毒侵染的组织作为外植体，在无抗性筛选标记的培养基上诱导产生再生植株。此外，通过在培养基中添加药物进行抗病毒处理，研究者发现核苷酸类似物利巴韦林可使100%的再生植株脱除病毒，并显著地提高了具有双等位/纯合突变的再生植株比例（图3）。后代遗传分析表明，再生植株的携带的杂合突变、双等位/纯合突变类型均可稳定传递至后代，传递规律符合经典的孟德尔遗传定律。

总之，该研究报道了一种基于工程化RNA病毒载体的CRISPR/Cas非转基因递送系统，该系统具有简易、稳定、高效、广谱、安全可控等优点，有效突破了植物遗传修饰中的基因递送瓶颈。鉴于TSWV广泛的宿主范围和非基因型依赖的侵染特性，该系统的发展可望推动基因编辑技术在相关作物基础研究和育种中的应用。

图3. 编辑植株再生技术流程及基因型分析

浙江大学农业与生物技术学院李正和教授为本文通讯作者，博士生刘倩、赵承露为该论文的共同第一作者，已毕业的孙凯博士（现单位为中国计量大学）和邓银露硕士也参与了部分工作，浙江大学植物病毒学团队周雪平教授和吴建祥教授等老师对本研究提供了大力支持。


通讯作者简介

李正和，浙江大学农业与生物技术学院教授、水稻生物学国家重点实验室成员。主要从事植物负链RNA病毒分子生物学、抗病毒靶标挖掘与利用、病毒载体发展及在基因编辑、生物合成的应用；先后主持国家重点研发计划课题、国家优秀青年基金和面上项目、浙江省杰出青年基金和重点项目等课题；在Nat Plants、Mol Plant、New Phytol、Ann Rev Phytopathol等刊物发表SCI论文50余篇；担任Virol J、Virol、Virol Sin、Viruses、Front Virol和Front Microbiol等期刊副主编或编委。课题组欢迎植物病毒学、园艺学、农学、植物生物学和生物技术相关专业的研究生和博士后加盟。