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负链RNA病毒（negative-strand RNA virus, NSV）包括在人和动物中广泛流行的一系列病原体，如埃博拉病毒（EBOV）、拉沙病毒（LASV）、尼帕病毒、狂犬病毒（RABV）、流感病毒和人类呼吸道合胞病毒（HRSV）1。作为全球经济和公共卫生的重大威胁，理解NSV复制的分子机制，以及开发针对NSV感染的新型抗病毒药物，对抵抗其感染至关重要。

根据病毒基因组的组成，NSV可以进一步分为非分段NSV（non-segmented NSV, nsNSV）和分段NSV （segmented NSV, sNSV），前者如EBOV，后者如流感病毒。nsNSV和sNSV的单链RNA基因组与病毒核蛋白组装成具有螺旋结构的病毒核糖核蛋白（viral ribonucleoprotein, vRNP）复合物2。在sNSV中，每个基因组RNA片段可以通过部分互补的5'和3'末端形成一个伪环，这些末端在同一组病毒中高度保守。而对于nsNSV，vRNA的5'和3'末端通常分别位于两个相反的末端2。

所有NSV都可以编码一个包含RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）结构域的大型RNA聚合酶，并在vRNP中对病毒RNA基因组进行复制或转录2。nsNSV的聚合酶在基因组的3'-末端启动转录，并顺序将前导区和内部基因转录到前导RNA和具有5'-帽子和3'-poly（A）尾的单顺式mRNA中2。据推测，nsNSV的转录遵循一种起始-终止机制（start-stop mechanism）：通过识别每个病毒基因两侧的基因起始（gene start, GS）和基因终止（gene end, GE）信号。在相应的GE信号处，当转录本的转录终止时，聚合酶应该要么从模板中解离，要么在其GS信号处继续合成下游转录本。对于基因组复制来说，聚合酶也从基因组的3'-末端开始，产生一个完整长度的互补基因组RNA，基因组中所有的GS和GE信号都会被聚合酶忽略。然而，聚合酶的功能在转录和复制之间切换的分子机制目前仍然不清楚，目前认为这种切换可能受到P蛋白的磷酸化状态或其他转录激活因子的调控3。

作为nsNSVs的代表，EBOV对人类具有高度的致病性，可以引起严重的临床症状，包括出血热和多器官功能衰竭。2023年9月13日，中科院的施一教授和高福教授共同通讯，在Nature上以加速预览的形式发表了题为Molecular mechanism of de novo replication by the Ebola virus polymerase的科研论文，报道了第一个L蛋白识别基因组启动元件机制的结构。在EBOV中， L-VP35复合物是发挥高效RNA聚合活性的基本功能单元，结合冷冻电镜，研究者解析了EBOV L-VP35复合物的整体结构，同时清楚地揭示了与辅因子VP35四聚体紧密相互作用的L蛋白活性位点的结构特征。

本研究共表达的EBOV L蛋白和VP35能够形成可溶且均一的L-VP35，在功能实验中，在RNA引物缺失的情况下，L-VP35能够以EBOV基因组RNA 3’端前导序列的18-mer RNA生成RNA产物，提示该复合物具有从头复制的活性。此外，研究者发现，当反应体系中只存在单一GTP底物时，L-VP35能够利用其3’端延伸活性对18-mer 前导RNA模板的3’端进行修饰，而当4种NTP底物同时存在时，这种活性却会减弱，鉴于类似的现象也在其他nsNSV中被观察到，提示这可能是nsNSV聚合酶共有的机制。此外，研究者发现，L-VP35的从头复制活性存在前导序列特异性，当前导序列被其他序列或其他nsNSV的前导序列取代时，其从头复制都无法正常进行。在以非前导序列作为模板时，3-mer或4-mer 才能驱动产物的生产，2-mer引物则无法发挥相同的作用，进一步实验提示，非特定RNA序列依赖性的复制过程是由RNA引物延伸所产生的。

图1. EBOV L-VP35具有从头转录活性

借助冷冻电镜，本文研究者进一步解析了L-VP35与 18-mer前导RNA形成的复合物结构，该结构整体分辨率达3.0 Å 。在本文结构中，L蛋白由N端结构域 （N-terminal domain, NTD）、RdRp结构域（含有典型的fingers-palm-thumb结构）以及GDP多核糖核苷转移酶 （GDP polyribonucleotidyltransferase, PRNTase）结构域组成，3’ RNA位于由fingers、NTD和PRNTase结构域所形成的模板进入通道（template entry channel）内。在复合物中，VP35四聚体以两种构象存在，与无底物结合的L-VP35相比，VP35四聚体的参与寡聚化的部分存在摆动现象，然而在目前的结构中，这种现象出现的原因尚且无法被阐明。

图2.  EBOV L-VP35-RNA复合物的整体结构

3’前导RNA在L蛋白的模板进入通道中以一种弯折的构象结合，并形成许多分子内相互作用以稳定这种构象。3’端G1、C2和C3互相堆叠在一起，U4、G5和U6堆叠在一起，两部分的连接处存在弯折。G7翻转到相反的方向，其位置由3对氢键稳定，U8与G7位于同一方向上，而G9又翻转到相反的方向。作为结构中最后一个可以被看见的核苷酸，U10进一步弯折，以适应RNA链在整个通道中所需要采取的构象。其中，G7是整个RNA链中构象特征最为显著的部分，且是唯一与U4形成相互作用的核苷酸。当G7被突变为A、U或C时，聚合酶会失去从头复制活性。

图3. 3’前导RNA的弯折构象

通过比对RNA结合的L-VP35结构与无底物的L-VP35结构，研究者发现除了NTD的尖端由于与G9结合发生了构象变化外，L蛋白的绝大部分在两个结构中可以被很好地吻合在一起。蛋白与RNA之间的相互作用主要通过氢键和π-π相互作用维持。

图4. EBOV聚合酶与前导RNA之间的相互作用

为进一步探究关键残基（NTD上的H49、R166、R170以及fingers️ domain上的R515）对L蛋白从头复制活性的影响，研究者将这些残基突变为丙氨酸，结果显示，单个/两个氨基酸残基的突变并不影响L-VP35与RNA链之间的高亲和力结合，然而，当4个氨基酸残基同时突变时，聚合酶对RNA链的亲和力下降了1,000倍之多。进一步功能分析提示，H49A突变不影响聚合酶从头复制活性，而R166A或R170A则会导致聚合酶活性下降，R515A会导致抑制复制活性，而4个突变同时存在时，复制活性完全消失。结合该酶在引物延伸方面的活性分析，研究者认为，这种特定的RNA构象对酶的从头复制活性有更大的影响。

图5. L蛋白突变对RNA结合以及合成的影响

综上，本文的结构揭示了EBOV RNA聚合酶识别基因组RNA以及复制的独特机制，对理解nsNSV RNA聚合酶作用的发挥提供了更多的细节信息。未来针对EBOV等nsNSV复制机制的研究，或许能给新型抗病毒药物的研发带来更多新思路。


原文链接 

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06608-1‍


参考文献

1. Ouizougun-Oubari, M. & Fearns, R. Structures and Mechanisms of Nonsegmented, Negative-Strand RNA Virus Polymerases. Annual Review of Virology (2023).

2. te Velthuis, A. J. W., Grimes, J. M. & Fodor, E. Structural insights into RNA polymerases of negative-sense RNA viruses (Jan, 10.1038/s41579-020-00501-8, 2021). Nature Reviews Microbiology 19, 220-220 (2021).

3. Liang, B. Structures of the Mononegavirales Polymerases. J Virol 94 (2020).