一、基因治疗的理念与发展

基因治疗是将外源性的正常基因或带有治疗作用的基因通过一定方式导入人体，以纠正或补充基因缺陷及异常所带来的疾病的治疗方案。1972年，美国生物学家T.Friefman和 R.Robin在《Science》杂志上发表文章《Gene therapy for human genetic disease?》，提出了基因疗法用于遗传疾病治疗的假设。这一篇文章被广泛认为具有划时代的前瞻性，打开了基因疗法的新时代。此后伴随着一系列临床试验的开展，基因治疗的发展经历了初期探索、狂热发展、曲折前行和再度繁荣四个阶段。

目前基因治疗有两种基本策略：第一种使用整合型载体，将基因导入前体细胞或者干细胞基因组，伴随着细胞的分裂将插入的基因传递至子代细胞；第二种则是使用非整合型载体，转入的基因独立存在于不具备分裂能力或者分裂速度极慢的宿主细胞核内，以实现相关基因的持续表达。目前针对这两种不同的治疗策略，基因治疗的具体治疗过程可以分为体外治疗和体内治疗两类。体外疗法一般使用整合型载体，对诸如造血干细胞等具有持续分裂能力的细胞进行基因插入。相对应的，体内治疗则使用非整合型载体，大多采用静脉注射等与一般药物类似的给药方式。

表1.部分已上市的基因治疗药物一览


二、基因疗法载体的选择

在诸多载体中，病毒由于其有较好的感染效率和在体内外靶细胞中持久表达的潜力，是第一种被用于人类基因治疗的基因载体。且到目前为止，病毒载体依然是人类基因治疗产品的主流工具，超过70%的基因治疗方案都应用了病毒载体，占据了基因治疗临床试验第一的位置。由于病毒具有致病性的部分已被事先移除了，因此它可以进入细胞核内，不会给患者带来其他风险。目前，主要应用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、简单疱疹病毒等。

腺病毒是一种没有包膜的双链DNA病毒，具有广泛的细胞和组织感染能力，且在已知的多种细胞中都不会整合进染色体中，因此也不会干扰正常基因。在体外应用时，腺病毒载体的转基因效率高（转导效率接近100%），并且可以转导不同类型的细胞，对于大量难转染细胞的基因递送是一个很好的工具。腺病毒的包装过程依赖于HEK293细胞系，其对宿主细胞的侵染过程是通过受体介导的内吞作用进入细胞内，基因组并不整合到宿主细胞基因组中，而是以游离状态在细胞核内表达，因而基于腺病毒载体的基因递送具有瞬时表达的特点。

腺相关病毒是迄今为止发现的一种结构最简单的单链DNA缺陷型病毒。由于其血清型多样，免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强等特点，经过改造的腺相关病毒被广泛应用在动物水平的基因表达和基因治疗中。利用腺相关病毒载体可以治疗多种疾病，包括阿尔兹海默病、关节炎、艾滋病感染、帕金森和多种癌症(主要是抑制血管生成和导入自杀基因)。虽然这些研究大多都只限于动物实验阶段，但应用于人体已经显示出可喜的前景。

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷Ⅰ型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。它对分裂细胞和非分裂细胞均有感染能力，可以有效的将外源性基因整合到宿主细胞的染色体上，从而达到持久性的表达，在转染能力方面，慢病毒对于一些传统方法很难转染的细胞，如神经细胞、原代细胞、干细胞和不分化细胞等具有较好的优势，同时它对于对腺病毒感染具有较强免疫反应的细胞3也具有很好的感染能力。在美国已经开展的临床试验中，慢病毒载体的参与可以起到良好的基因治疗的效果，因此慢病毒在基因治疗领域内也拥有非常广阔的应用前景。


三、病毒包装细胞的选择

然而由于病毒缺乏复制机制，需要细胞来“存活”，慢病毒载体传递系统最重要的一个方面就是慢病毒的生产，通常在HEK 293细胞系中进行。HEK 293细胞系是1973年产生的人胚胎肾细胞293。它们是一种典型的衍生自人体胚胎肾细胞的细胞系，具有较高的转染效率，同时也易于培养，且极少表达细胞外配体所需的内生受体，因此常用于表达研究外源基因。

HEK-293贴壁和悬浮培养对比

HEK 293细胞的培养方式有贴壁培养和悬浮培养两种，贴壁培养需要胰酶消化或其他类型的消化液消化，才能够实现细胞的传代，而悬浮培养可以直接取悬浮的细胞加入新鲜的培养基进行传代。其次，悬浮培养对血清依赖较小，因此在传代培养的简便性上，悬浮培养就更加简便。在生产放大能力上，虽然贴壁培养有细胞工厂的方式进行放大培养，但是悬浮培养因为可以使用反应罐进行几百升甚至上千升的培养所以比贴壁培养放大的能力更强。由于悬浮培养存在的工艺简便性导致悬浮培养的产物纯化操作也更加方便。总之，悬浮培养具有易生产放大、工艺流程简便、更低的成本等优势，目前药企大部分都会采用悬浮培养的方式进行病毒的生产。


四、病毒的生产工艺

据文献报道，张同存等人采用驯化的293T悬浮细胞在15L机械搅拌式生物反应器中进行培养，以3.5×105-5.0×105 个/mL 的密度接种，与无血清基础培养基组成5.5L的培养体系。设置培养参数：pH7.0-7.2，溶氧40%-70%，底部L型大泡通气通入O2/CO2/Air，转速130 rpm，温度37 ℃。最终结果在5.5d左右细胞密度随时间的增加而增加，且细胞活率均大于90%，与种子细胞活率相比没有明显差异。其包装慢病毒原液活性滴度为6.5×107 TU/mL，与细胞工厂相比提高了34倍（1.9×106 TU/mL），生物反应器中细胞的产毒率为43 TU/cell，是细胞工厂的6倍（7 TU/cell），而细胞工厂在耗材成本上是反应器的5倍。

由此可知，通过生物反应器培养293细胞进行慢病毒包装是一种非常具有发展前景的手段，同时对于大规模生产也具有参考意义。然而在目前HEK293的悬浮培养中，由于需要配合高密度无血清培养的培养基配方，在缺少血清和蛋白的保护作用下，使得HEK293对剪切力的敏感度增加，从而提高了培养难度。因此，当细胞株进行悬浮培养放大的时候，更适合使用低剪切力的生物反应器。在工艺研发和优化阶段，奥星可提供BIOSYSTEC系列玻璃生物反应器助力研发，而在种子扩增阶段，奥星提供更为温和的反应体系，如WAVE反应器。

图：基因治疗药物的生产工艺


五、BIOSYSTEC系列生物反应器的应用案例

苏州某基因治疗用户采用BIOSYSTEC系列玻璃生物反应器15L培养293细胞进行瞬时转染，以3.5×105-5.0×105 cells/mL 的密度接种。设置培养参数：转染前pH7.10 ± 0.25，转染后pH7.00 ± 0.25；溶氧40%；温度37 ℃；转速140-180 rpm。在培养过程中通过CO2和7.5%碳酸氢钠控制pH，通过空气和氧气控制溶氧DO，底部环型大泡通气通入O2/CO2/Air，底部 Air通气流量10 -40 mL/min。

BIOSYSTEC反应器控制方案

在培养的过程中，BIOSYSTEC生物反应器展现出了强大的控制能力，对基础参数的控制非常稳定，控制系统采用智能PID参数控制，并将参数修改权限开放给用户，可以满足复杂的控制策略，完美的实现了用户的工艺控制需求。在此基础上，BIOSYSTEC 系列生物反应器平台也可以整合过程分析技术（PAT），搭载在线拉曼系统，实现葡萄糖、乳酸、VCD、TCD以及渗透压等关键参数的实时在线监测。

最终结果显示，在5d左右细胞密度随时间的增加而增加，最终可以达到3.24×106 cells/mL ，且最终细胞活率可以保持在90%左右。

培养过程控制参数

除此之外，BIOSYSTEC系列最新推出了WAVE生物反应器，同样也可以适用于HEK-293细胞的培养。WAVE反应器也叫做波浪式一次性生物反应器，由于采用波浪式摇动的混合方式取代搅拌桨搅拌混合，也因此具有独特的优势。首先，波浪式摇动是一个温和且高效的混合方式，有效的避免了搅拌桨对细胞的剪切力的伤害，并且可以显著提高体积传氧系数，这样就使得细胞有更快的生长速度和更高的密度；其次，WAVE反应器使用预先经过放射灭菌的培养袋取代罐体作为反应容器，省去了反应器清洗、消毒灭菌、验证等繁琐的工作，节省时间，提高工作效率。同时还能有效防止染菌，降低产物中的内毒素水平，也可以防止不同培养之间的交叉污染，可以适用于cGMP生产，当然也可以实现在非洁净环境中的无菌取样；最后，WAVE反应器可以兼容连续灌注等多种培养方式，可以通过重力实现自动连续收获和补料，操作简单可靠。

该基因治疗用户使用WAVE生物反应器进行HEK-293F细胞的扩增，作为中试生产的种子细胞，在一周内快速获得了大量的种子细胞，缩短了生产周期，完美解决了摇瓶生产力不足的问题。用户以3.5×105-5.0×105 cells/mL 的密度接种，结果显示，细胞密度可达3.24×106 cells/mL，活率则能维持在95%以上。


参考文献：

1. JL, S., et al., Immune Responses to Viral Gene Therapy Vectors. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 2020. 28(3): p. 709-722.

2. MC, M. and O.D. U, Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia, 2018. 32(7): p. 1529-1541.

3. BJ, C., et al., Perspective on Adenoviruses: Epidemiology, Pathogenicity, and Gene Therapy. Biomedicines, 2019. 7(3).

4. 唐取来,顾力行,周勇,等.机械搅拌式生物反应器悬浮培养293T细胞生产慢病毒的工艺[J].河南农业大学学报,2021,55(2):314-320.